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植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)葉綠體色素含量的測(cè)定 ----分光光度法 摘要: 葉綠體色素溶液各組成成分在可見光譜中具有不同的特征吸收峰。因此乙醇含量，應(yīng)用分光光度 計(jì)在某一特定波長下所測(cè)定的吸光度。葉綠體色素的提取常用丙酮和乙醇有機(jī)溶劑。葉綠體 色素 95 ％乙醇提取液中葉綠素 及類胡蘿卜素分別在665nm 470nm波長下具有最大吸收峰汽油檢測(cè)儀，據(jù)此所測(cè)得的吸光度值代人不同的經(jīng)驗(yàn)公式（見結(jié)果計(jì)算），計(jì)算 出葉綠體色素乙醇提取液中葉綠素 的濃度及其葉綠素總濃度和類胡蘿卜素的總濃度，并依據(jù)所使用的單位植物組織（鮮重、干重或面積）甲醇檢測(cè)儀，求算出色素的含量。 實(shí)驗(yàn)原理與實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理： 利用95%乙醇提取葉綠體色素，葉綠素a、葉綠素 和類胡蘿卜素最大吸收峰的波長分別是665nm、649nm和470nm。 根據(jù)分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度值，可以計(jì)算出乙醇提取液中葉綠體色素含量。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握分光光度法對(duì)葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總濃度和類胡蘿卜素總濃度測(cè)定和計(jì)算的 方法。 實(shí)驗(yàn)材料和方法植物材料：菠菜葉片、番茄幼苗葉片 實(shí)驗(yàn)用具：分光光度計(jì)、天平、研缽、漏斗、剪刀、容量瓶、燒杯、濾紙、滴管等 實(shí)驗(yàn)試劑：95%乙醇、石英砂和碳酸鈣 試驗(yàn)方法：分光光度法 葉綠體色素的提取取新鮮菠菜葉片（或番茄幼苗葉片）0.5 克,擦干,去中脈,剪碎放入研缽;加入少許石英砂 和CaCO ,再加入95%乙醇3ml,研磨成勻漿,再加95%乙醇10ml,靜置10分鐘;用漏斗濾去殘 渣,用丙酮反復(fù)沖洗研缽、殘?jiān)翢o色;用容量瓶定容至50ml 2、吸光度的測(cè)定取光徑1cm 比色杯，注入上述葉綠素提取液,以95%乙醇注入另一同樣的比色杯內(nèi)作為 空白對(duì)照,在波長665、649 和470nm 下測(cè)定吸光度。

3、結(jié)果計(jì)算 依據(jù)下列丙酮提取液中色素濃度計(jì)算公式,分別計(jì)算出葉綠素a、b 的濃度及其葉綠素總 濃度和類胡蘿卜素的濃度。 附錄：722 分光光度計(jì)的使用 1、選擇靈敏度旋紐至3；將波長調(diào)節(jié)到600nm，打開樣品室蓋，打開電源開關(guān)預(yù)熱20min。 2、打開樣品室蓋，將測(cè)定旋紐調(diào)至T（透光度），用調(diào)節(jié)旋紐0 調(diào)0；蓋上樣品室蓋，用調(diào) 節(jié)旋紐100 調(diào)100。 3、將空白樣品放入樣品槽，按上述方法調(diào)0 和調(diào)100。 4、將測(cè)定旋紐調(diào)至A（吸光度），用Abs 旋紐調(diào)0，測(cè)定待測(cè)樣品的光密度。 計(jì)算公式： 95%乙醇提取液中色素濃度的計(jì)算 （葉綠素a）=13.95A665 6.8A649 （葉綠素b）=24.96A649 7.32A665 =18.16A649 6.63A665 x.c（類胡蘿卜素）=(1000A 470 )/248葉綠體色素含量= 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1、菠菜葉片不同波長下的吸光度(0.42g) 波長（nm） 吸光度 平均值 665 0.702 0.683 0.755 0.7133 649 0.328 0.326 0.340 0.3313 470 0.823 0.827 0.861 0.8370 （葉綠素a）=13.95*0.7133–6.8*0.3313=7.6977mg/L （葉綠素b）=24.96*0.3313–7.32*0.7133=3.0479mg/L =18.16*0.3313+6.63*0.7133=10.7456mg/L x.c（類胡蘿卜素）=(1000A 470 樣品鮮重（或干重、面稀釋倍數(shù) （葉綠素b）含量=3.0479mg/L*0.05L*1/0.42g=36.28mg/g x.c（類胡蘿卜素）含量=1.8995mg/L*0.05L*1/0.42g=22.61mg/g 2、1#番茄幼苗葉片不同波長下的吸光度(0.34g) 波長（nm） 吸光度 平均值 665 0.463 0.452 0.453 0.4560 649 0.203 0.264 0.275 0.2473 470 0.492 0.464 0.479 0.4783 （葉綠素a）=13.95*0.4560–6.8*0.2473=4.6796mg/L （葉綠素b）=24.96*0.2473–7.32*0.4560=2.8347mg/L =18.16*0.2473+6.63*0.4560=7.5142mg/L x.c（類胡蘿卜素）=(1000 x.c（類胡蘿卜素）含量=0.5778mg/L*0.05L*1/0.34g=8.50mg/g 3、4#番茄幼苗葉片不同波長下的吸光度(0.2g) 波長（nm） 吸光度 平均值 665 0.219 0.225 0.231 0.2250 649 0.113 0.117 0.124 0.1180 470 0.253 0.259 0.268 0.2600 （葉綠素a）=13.95*0.2250–6.8*0.1180=2.33636mg/L （葉綠素b）=24.96*0.1180–7.32*0.2250=1.29828mg/L =18.16*0.1180+6.63*0.2250=3.6353mg/L x.c（類胡蘿卜素）=(1000* （葉綠素b）含量=1.29828mg/L*0.05L*1/0.2g=32.457mg/g x.c（類胡蘿卜素）含量=0.43mg/L*0.05L*1/0.2g=10.75mg/g 討論： 葉綠素a、b 在藍(lán)色區(qū)也有吸收峰，能否用這一吸收峰波長進(jìn)行葉綠素的定量分析？為 什么？ 答：不能。定量分析的吸收峰必須要穩(wěn)定，還要有強(qiáng)的吸收；另外乙醇含量，還需要考慮干擾 的問題。光合色素除了葉綠素外還有類胡蘿卜素，類胡蘿卜素主要吸收藍(lán)光乙醇含量，為了排 除干擾要選用紅光。 參考文獻(xiàn)： 王英典，劉

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